免疫染色 BSA 濃度

Your browser does not have JavaScript enabled and some parts of this website will not work without it.アブカムでは最適な動作のために 免疫組織染色においては、試料の調製法が組織形態と抗原構造の維持を左右するため、その選択は非常に重要です。

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血清、BSA（ウシ血清アルブミン）、スキムミルクなどのタンパク質を用いたブロッキングは、組織サンプルへの抗体の非特異的結合を防ぐために行います。理論的には、検出したいターゲットのエピトープへ結合しなければ、どのようなタンパク質でもブロッキング剤として用いることができます。血清には抗体タンパク質（イムノグロブリン）が多量に含まれています。一次抗体や二次抗体が非特異的に結合しやすい組織サンプル中の部位、例えば Fc 受容体などには、血清中の抗体タンパク質もまた非 … 実験のステップごとの詳細 蛍光免疫染色の概要 • ソヱハキ質の発現の確認 • ソヱハキ質の局在性の確認 • 上記を細胞や組織の形態と 照らし合わせて観察 • 酵素抗体治＆発色＇と比較して • 両方とも高感度 • 多重染色が容易 • 長期保存は不向き 固定 膜の洙透処理 ピルチカヱギ

正常結腸組織中のビメンチンおよびラミンB1の蛍光IHC検出。Thermo Scientific Blocker BSA Blocking Bufferを用いて正常ヒト大腸組織切をブロッキングした後、 抗ビメンチンに次いでThermo Scientific DyLight 405 Goat Anti-Mouseでインキュベーションしました。 bsa 0.3 ～3 % 価格もそれほど高価でなく、良好なシグナル強度が得られます。通常0.3 ～3% の濃度でpbs に加えて使用します。（参照 文献12 ～20） 炭水化 物 の夾雑 があ るで 、レ クチ ンを用い 場合 バッ グラウ ドが高くなる可能性があります。

参照）。また正電荷を帯びたスライドグラスを使用するのも有効です。組織切片のタンパク質は負の電荷を帯びていることが多いからです。正電荷を帯びたスライドグラスとしては、通常のスライドグラスを各種試薬（ポリ-L-リジン、APES（3-アミノプロピルトリエトキシシラン）など）でコーティングするか、市販の正電荷付与済みスライドグラスを使用してください。パラフィン切片でも凍結切片でも、切片とスライドとの間には水分が残ります。スライドと組織の間の分子間相互作用を最大限にして接着を強くするため、また続く染色過程における悪影響を抑えるため、この水分はできるだけ取り除いてください。パラフィン切片の場合は、キシレンやエタノールで脱パラフィンする前に、56℃ の乾いたインキュベーター内で少なくとも 30 分は乾燥させて下さい。切片とスライドの間隙からの水分の排水を促すため、乾燥はスライドを垂直に立てて行います。凍結切片の場合は、薄片にした後少なくとも 30 分室温で乾燥させ、その後アセトン、メタノールなどの固定剤で固定し、さらに再度乾燥させます。凍結切片をパラホルムアルデヒドやホルマリンで固定した場合は、固定後の乾燥は必要ありません（そのまま染色のステップに進みます）。ある抗体を免疫組織染色で初めて用いる場合には、まずは目的の抗原が存在することが明らかな組織切片を用いて試してみることをお勧めします。免疫組織染色で使用できることが確認済みの抗体と、一緒に操作を行うことができれば、なお確実です（うまくいかなかった場合の得られた染色像が特異的な反応によるものである（言いかえれば、一次抗体あるいは二次抗体の非特異的結合によるものではない）ということを証明するためには、ネガティブ･コントロールとしてアイソタイプ・コントロールを用いた実験が必要です。一次抗体を含まない反応液か、または一次抗体をアイソタイプ・コントロール（一次抗体と同じアイソタイプでかつ試料と絶対に特異的に反応しない抗体 （抗 KLH、抗 DNP など））に置き換えた反応液を用い、同じ条件で操作を行い判定してください。一次抗体として未精製の抗血清を使用している場合、ネガティブ・コントロールは、免疫していていない同じ動物種の未精製血清を用いてください。アイソタイプ・コントロールにつきましては、二次抗体 FAQ のページの「高いバックグランウンドや偽陽性が認められる場合、抗体とタンパク質の非特異的結合のブロッキングが不十分であることがまず考えられます。二次抗体の免疫動物と同種の 5-10% 正常血清（非免疫動物の血清）を使用してください（一次抗体が直接標識されている場合には、一次抗体の免疫動物と同種の正常血清）。BSA やカゼイン、スキムミルクを含むブロッキング試薬も有用です。またアブカムの 不十分なブロッキング以外の原因としては下記も考えられます。 参照）。また正電荷を帯びたスライドグラスを使用するのも有効です。組織切片のタンパク質は負の電荷を帯びていることが多いからです。正電荷を帯びたスライドグラスとしては、通常のスライドグラスを各種試薬（ポリ-L-リジン、APES（3-アミノプロピルトリエトキシシラン）など）でコーティングするか、市販の正電荷付与済みスライドグラスを使用してください。パラフィン切片でも凍結切片でも、切片とスライドとの間には水分が残ります。スライドと組織の間の分子間相互作用を最大限にして接着を強くするため、また続く染色過程における悪影響を抑えるため、この水分はできるだけ取り除いてください。パラフィン切片の場合は、キシレンやエタノールで脱パラフィンする前に、56℃ の乾いたインキュベーター内で少なくとも 30 分は乾燥させて下さい。切片とスライドの間隙からの水分の排水を促すため、乾燥はスライドを垂直に立てて行います。凍結切片の場合は、薄片にした後少なくとも 30 分室温で乾燥させ、その後アセトン、メタノールなどの固定剤で固定し、さらに再度乾燥させます。凍結切片をパラホルムアルデヒドやホルマリンで固定した場合は、固定後の乾燥は必要ありません（そのまま染色のステップに進みます）。ある抗体を免疫組織染色で初めて用いる場合には、まずは目的の抗原が存在することが明らかな組織切片を用いて試してみることをお勧めします。免疫組織染色で使用できることが確認済みの抗体と、一緒に操作を行うことができれば、なお確実です（うまくいかなかった場合の得られた染色像が特異的な反応によるものである（言いかえれば、一次抗体あるいは二次抗体の非特異的結合によるものではない）ということを証明するためには、ネガティブ･コントロールとしてアイソタイプ・コントロールを用いた実験が必要です。一次抗体を含まない反応液か、または一次抗体をアイソタイプ・コントロール（一次抗体と同じアイソタイプでかつ試料と絶対に特異的に反応しない抗体 （抗 KLH、抗 DNP など））に置き換えた反応液を用い、同じ条件で操作を行い判定してください。一次抗体として未精製の抗血清を使用している場合、ネガティブ・コントロールは、免疫していていない同じ動物種の未精製血清を用いてください。アイソタイプ・コントロールにつきましては、二次抗体 FAQ のページの「高いバックグランウンドや偽陽性が認められる場合、抗体とタンパク質の非特異的結合のブロッキングが不十分であることがまず考えられます。二次抗体の免疫動物と同種の 5-10% 正常血清（非免疫動物の血清）を使用してください（一次抗体が直接標識されている場合には、一次抗体の免疫動物と同種の正常血清）。BSA やカゼイン、スキムミルクを含むブロッキング試薬も有用です。またアブカムの 不十分なブロッキング以外の原因としては下記も考えられます。

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